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本制品由携带T4噬菌体的大肠杆菌产生，催化双螺旋DNA或RNA中的5-磷酸基和3-羟基端之间磷酸二酯键的形成。可将DNA片段与粘性末端或平末端连接，能够修复双螺旋DNA、RNA或DNA/RNA杂合体中的单链缺口，但对单链核酸无活性。适用于标记RNA 3'-末端，环化RNA和DNA寡聚核苷酸及克隆cDNA等。反应需要ATP作为辅助因子，在室温下完成粘性末端连接仅需10min。操作简便，可实现快速、高效连接。

• 核酸内切酶残留检测：37℃条件下，将200U的T4 DNA快速连接酶与1μg的pUC 19 DNA共孵育4h，DNA电泳未检测出共价闭合环状DNA转化为缺口DNA。
  
• 核酸外切酶残留检测：将T4 DNA快速连接酶与双链DNA在37℃共孵育16h，DNA电泳未检测出双链DNA降解。
  
• 蓝白斑检测：室温条件下，将30U的T4 DNA快速连接酶与pUC 57 DNA-Hind III，pUC 57 DNA-Pst I或pUC 57 DNA-San I消化产物共孵育1h，用E.coli XL 1-Blue感受态细胞转化连接产物，检测到白斑量少于1%。

• Buffer在融解时，如果出现少量沉淀属正常现象，请颠倒混匀后使用。
  
• 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
  
• T4 DNA快速连接酶在浓度高于200mM的NaCl或KCl中会被强烈抑制。
  
• 连接反应液添加量不应该超过感受态细胞体积的10%，不推荐体系中加入过量的T4 DNA快速连接酶。
  
• T4 DNA连接酶与DNA的结合可能导致琼脂糖凝胶中发生条带位移。为避免发生这种情况，可使用6×DNA Loading或SDS溶液在70℃孵育5min或65℃孵育10min，在冰上冷却后进行电泳。
  
• 聚乙二醇(PEG)能极大地提高平末端连接的连接效率，PEG 8000的推荐添加量是连接体系的5% (w/v)。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• DNA片段（粘性末端与平末端）与载体DNA连接
  
  • 参考下表设置连接反应体系（冰上操作）。
    

    成分	粘性末端连接体系	平末端连接体系
    Vector DNA	20～100ng
    Insert DNA	3:1～10:1 (与载体的摩尔比)
    50% PEG	-	2μL
    10×T4 DNA Ligase Buffer	2μL
    T4 DNA快速连接酶(5U/μL)	1U(0.2μL)	5U(1μL)
    ddH2O	至20μL

    • 如果载体进行的是单酶切，须进行酶切后的去磷酸化处理，避免产生较多载体自连的克隆。
  • 连接体系用移液枪轻轻吹打混匀，瞬离。粘性末端连接体系于22℃孵育10min，平末端连接体系于22℃孵育1h。
    
  • 取1～5μL连接产物用于50μL化学感受态细胞的转化或取1～2μL连接产物用于50μL电转感受态细胞的转化。
    
    • 如果连接产物用于电转化，应使用离心柱或氯仿抽提纯化DNA来代替热失活步骤。
• 线性DNA自身环化的连接
  
  • 参考下表设置连接反应体系（冰上操作）
    

    成分	用量
    Linear DNA	10～50ng
    10×T4 DNA Ligase Buffer	5μL
    T4 DNA快速连接酶(5U/μL)	5U(1μL)
    ddH2O	至50μL

  • 连接体系用移液枪轻轻吹打混匀，瞬离。22℃孵育10min。
    
  • 取1～5μL连接产物用于50μL化学感受态细胞的转化或取1～2μL连接产物用于50μL电转感受态细胞的转化。
    
    • 如果连接产物用于电转化，应使用离心柱或氯仿抽提纯化DNA来代替热失活步骤。
• 接头连接
  双链寡核苷酸连接体通常用于在插入片段中产生粘性末端。连接子通常含有限制性酶识别序列，在连接后消化产生和克隆载体匹配的粘性末端。如果连接子已包含于克隆载体匹配的粘性末端，可随时与克隆载体连接无需进行插入片段的进一步处理。
  
  • 参考下表设置连接反应体系（冰上操作）。
    

    成分	用量
    Linear DNA	100～500ng
    Phosphorylated linkers	1～2μg
    50% PEG	2μL
    10×T4 DNA Ligase Buffer	2μL
    T4 DNA快速连接酶(5U/μL)	2U(0.4μL)
    ddH2O	To 20μL

  • 连接体系用移液枪轻轻吹打混匀，瞬离。22℃孵育10min。
    
  • 65℃孵育10min或70℃孵育5min，进行热失活。
    
    • 接头连接反应可在最适合后续消化的限制性酶缓冲液中进行，以简化“接头连接-酶切”实验流程。具体方法为：向接头连接体系中添加ATP至终浓度1mM，进行接头连接反应。反应完成后，失活T4 DNA快速连接酶。最后，在在体系中加入所需内切酶进行酶切。